Наверно, сложно найти человека, который бы не слышал о методе редактирования генома под названием CRISPR (или CRISPR/Cas). В его основе – система противовирусной защиты бактерий, которые умеют распознавать вирусную ДНК, когда она появляется в бактериальной клетке.
Биотехнологи взяли ферменты бактерий, с помощью которых те уничтожают ДНК вирусов, и приспособили их для работы в клетках животных. Суть редактирующей системы, если двух словах, выглядит так: белок ищет в клеточных хромосомах участок, который нужно вырезать, а в качестве «путеводителя» ферменту дают молекулу РНК с той же последовательностью нуклеотидов, что и в нужном участке. Сверяя РНК, которую он носит с собой, с клеточной ДНК, фермент в конце концов находит нужное место в геноме, и вырезает его. Если здесь была мутация, она исчезнет – клеточные системы ремонта ДНК сами заделают образовавшуюся дыру так, что никакой мутации тут уже не будет.
Еще раз скажем, что это очень упрощенное описание того, как работает геномный редактор CRISPR. Сейчас он существует уже в нескольких вариантах, с разными белками, которые режут ДНК так или этак. Но в любом случае понятно, сколь огромные перспективы открываются тут для биоинженерии и медицины: огромное число болезней развиваются из-за дефектов в нашей ДНК, так что инструмент, который позволял бы такие дефекты устранять, был бы очень кстати.
Много шума наделала статья китайских исследователей, которые с помощью CRISPR отредактировали геном человеческого эмбриона, и все больше появляется работ, авторы которых описывают, как им удалось исправить тот или иной мутантный ген либо в культуре клеток, либо в зародыше животного. Но если мы беремся редактировать геном, то должны быть уверены, что изменения коснутся только того участка, который мы выбрали. Между тем метод CRISPR, хотя и считается намного более точным, чем другие способы исправления ДНК, стопроцентной точностью похвастаться все же не может: редактирующие ферменты правят ДНК там, где не должны. На этот случай, вообще говоря, разработаны программы, позволяющие предсказать, куда еще может направиться система CRISPR – зная, какие участки в геноме для нее особо привлекательны, можно постараться заранее сделать так, чтобы редактирующие ферменты туда все-таки не шли. Однако, как показали эксперименты исследователей из Стэнфорда, Университета Айовы и Колумбийского университета, даже с помощью специальных алгоритмов не всегда можно угадать, куда вмешается система CRISPR.
Келли Шейфер (Kellie A. Schaefer) и ее коллеги проанализировали геном мышей, которых с помощью CRISPR попытались избавить от мутаций, ведущих к пигментному ретиниту – дегенеративному заболеванию сетчатки, часто заканчивающемуся слепотой. Удалить вредные мутации вполне получилось, но, кроме того, как пишут авторы работы в письме в Nature Methods, они нашли в геноме более полутора тысяч мутаций, связанных с изменениями одного нуклеотида, и более ста мутаций, связанных с вставками и удалениями более крупных фрагментов ДНК. По словам авторов работы, все предсказательные алгоритмы, которые используются сейчас для оценки точности CRISPR, прошли мимо этих исправлений. Обнаружить же их удалось потому, что геном мышей читали полностью, а не только в зонах риска, где можно было ожидать от CRISPR самодеятельности.
С другой стороны, сами животные никак от массы мутаций не страдали, то есть мутации либо попали в те участки ДНК, от которых мало что зависит в повседневной жизни, либо же тут сработали какие-то компенсирующие механизмы. Но в любом случае очевидно, что прежде чем говорить о каком-то практическом использовании CRISPR-редактирования в медицине, нужно проделать очень большую работу, чтобы метод стал абсолютно точным.
В начале февраля 2016 года стало известно, что правительство Великобритании разрешило ученым изменять ДНК человеческих эмбрионов в исследовательских целях с помощью системы CRISPR. Речь не идет о создании ГМО-людей, поскольку все модифицированные эмбрионы, полученные через экстракорпоральное оплодотворение, через 14 дней будут уничтожаться. Однако общественность сильно обеспокоилась. Например, директор национальной разведки США Джеймс Клэппер заявил, что потенциально технологии редактирования генома – это оружие массового поражения. Его пессимистический прогноз воплотили в сериале «Секретные материалы», где систему CRISPR использовали для глобального геноцида. Что же такое технология CRISPR, почему она вызывает столько ажиотажа среди ученых, опасений у общественности и что в действительности может дать человечеству?
CRISPR – это иммунная система бактерий и архей, спасающая микроорганизмы от вирусов. Впервые она была обнаружена японскими учеными в конце 1980-х годов у бактерии Escherichia coli (кишечная палочка). Они заметили, что в геноме бактерии присутствуют повторяющиеся последовательности, разделенные спейсерами – уникальными участками. Однако какую роль все это выполняет, тогда выяснить не смогли. Схожую генетическую структуру-кассету нашли позднее у другого микроорганизма – археи Haloferax mediterranei, а затем и у многих других прокариот. Такие участки стали называть акронимом CRISPR, то есть Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. По-русски – «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами».
Спустя более десяти лет генетики установили, что рядом с CRISPR-кассетами располагаются гены, которые кодируют белки, названные Cas. Известные спейсеры сравнили с последовательностями ДНК из обширных баз геномных данных. Оказалось, что спейсеры очень похожи на участки геномов вирусов-бактериофагов, а также плазмид – кольцевых молекул ДНК, обычно встречающихся у бактерий.
Группа биоинформатиков под руководством Евгения Кунина из Национального центра биотехнологической информации предложила механизм работы CRISPR-кассет и ассоциированных с ними белков Cas. Вирус, проникший в клетку бактерии, обнаруживается комплексом белков Cas, несущих с собой последовательность спейсера. Если последняя совпадает с участком ДНК вируса (протоспейсером), то белки Cas разрезают чужеродную ДНК, предотвращая инфекцию. Позже ученые сумели внести в CRISPR-кассету бактерии спейсер с фрагментом генома бактериофага и наблюдали, как микроорганизм успешно справился с вирусом. Это послужило одним из доказательств предложенной гипотезы.
Спейсеры в CRISPR-кассетах – это шаблон для производства crРНК, которая и отправляется вместе с Cas-белками в атаку на вирус. Откуда же спейсеры берутся? Когда бактерия сталкивается с неизвестным вирусом, она начинает вырезать различные участки ДНК из своего и чужого генома и вставлять их в кассету. Конечно, большинство таких кусков оказываются бесполезными и даже вредными, однако тот, что помогает организму побороть инфекцию, остается в CRISPR и передается потомкам бактерии.
Выяснилось, что существует несколько разновидностей системы CRISPR-Cas. Одна из них кодирует не комплекс белков Cas, а всего лишь один – Cas9. Это универсальная молекула, выполняющая сразу несколько функций: она связывает чужеродную ДНК и разрезает ее. Именно в системе с белком Cas9 ученые увидели точный инструмент редактирования генома. В статье, опубликованной в журнале Science в 2012 году, Эммануэль Шарпентье и Дженнифер Дудна предложили в качестве crРНК искусственные последовательности, которые узнавали бы определенные участки ДНК. Тогда Cas9 вносил бы разрезы туда, куда это нужно ученым. Другая исследовательская группа примерно в это же время показала, что система CRISPR-Cas9 может работать с геномами не только в бактериях, но и в клетках других организмов, включая человека.
И до CRISPR-системы были известны способы редактирования генома. Например, с помощью нуклеаз, содержащих цинковые пальцы. Это искусственные ферменты, не существующие в природе и способные расщеплять цепочку ДНК. Цинковый палец – особый белковый модуль, включающий в себя один или несколько ионов цинка. Именно с помощью подобных структур ферменты взаимодействуют с ДНК, РНК и другими молекулами. Ученые соединили цинковый палец с другим модулем, разрезающим цепочку ДНК. Такие нуклеазы могут быть нацелены на определенные участки генома, где и производят разрезы. Проблема в том, что для каждого участка, куда нужно внести разрыв, необходимо синтезировать, выделить и проверить специфичный белок. Кроме того, применение нуклеаз сопряжено с большой вероятностью ошибок: часто разрывы происходили не в тех местах, что были нужны.
Система CRISPR-Cas гораздо удобнее. Функцию разреза на себя берет белок Cas9, одинаковый для любых локусов-мишеней. Все, что нужно сделать, это синтезировать crРНК, которая укажет белку, где именно внести двуцепочечный разрыв. После того как разрыв внесен, включаются системы восстановления ДНК. Во-первых, это механизм негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ), в результате чего возникают различные мутации, нарушающие функции генов. Если сделать множество таких разрывов, то можно добиться перестройки крупного участка ДНК.
Во-вторых – гомологичная рекомбинация (homologous recombination, HR), когда похожие или идентичные участки ДНК обмениваются между собой нуклеотидными последовательностями. Такой механизм используется для восстановления повреждений двойной цепи, называемых двунитевыми разрывами.
Что касается управляемого редактирования ДНК, то ученым больше подходит гомологичная рекомбинация. С помощью системы CRISPR-Cas можно внести разрывы так, чтобы убрать из ДНК целый участок. При этом генетики подсовывают созданную ими последовательность, которая встраивается на место удаленной. Таким образом можно «ремонтировать» мутации, вызывающие тяжелые заболевания. Ученые убирают дефектный участок гена и заменяют его на нормальный. Более того, можно вносить новые мутации, создавать различные варианты одного и того же гена, добавлять к нему специфические последовательности, что отражается на функциях кодируемого им белка.
Можно исправлять сразу множество дефектных генов. Для этого нужно лишь синтезировать соответствующие crРНК, чьи последовательности совпадают с нужными участками ДНК. Белки Cas9 связываются с crРНК и устремляются «чинить» гены. Следует уточнить, что когда мы говорим о совпадении, то имеем в виду комплементарное соответствие. Принцип комплементарности показывает, в каком случае между различными цепочками ДНК или РНК будут образовываться связи. Нуклеотид А связывается с нуклеотидом Т, а нуклеотид С – с G. Поэтому, например, фрагмент ACTG совпадает с TGAC.
Когда стало понятно, что CRISPR-систему можно использовать для редактирования генома человека, множество лабораторий по всему свету занялись активными исследованиями. Например, используют технологию для создания генно-модифицированных организмов. Одно из направлений – создание кисломолочных бактерий, которые могли бы сопротивляться атаке бактериофагов, уничтожающих культуры полезных микроорганизмов. Но пожалуй, одно из самых интересных применений CRISPR – борьба с ретровирусными инфекциями.
Ретровирусы – к ним относится ВИЧ – вставляют свой геном прямо в ДНК зараженной клетки. В журнале Scientific Reports опубликована работа, демонстрирующая, как с помощью CRISPR-Cas9 можно очистить пораженные ВИЧ Т-лимфоциты и даже воспрепятствовать повторному встраиванию вируса. Генетики просто-напросто внесли в культуру T-клеток гены, кодирующие crРНК и Cas9, которые, в свою очередь, успешно вырезали ДНК вируса из генома лимфоцитов.
Китайские ученые проводили эксперименты на эмбрионах человека еще до того, как подобные исследования разрешили в Великобритании. В апреле 2016 года генетики сообщили, что они изменили гены зародышей, чтобы сделать их неуязвимыми к ВИЧ. С помощью CRISPR они внесли ген, который встречается у людей, невосприимчивых к инфекции.
Пригодилась система CRISPR и в борьбе с раком. Например, в работе, опубликованной в Nature Biotechnology, показано, что с помощью модифицированного белка Cas9 можно отключать определенные гены и тем самым определять их роль в перерождении нормальных клеток в злокачественные. Если выяснится, что мутация в определенном гене способствует развитию рака, то следующий шаг – исправление дефекта с помощью генетических манипуляций.
CRISPR способен помочь в лечении рака крови – лейкемии. Вместо того чтобы искать донора костного мозга, можно взять образцы тканей кроветворного органа самого пациента, исправить дефективные стволовые клетки, избавив их от роковой мутации, а затем пересадить обратно. Если злокачественные клетки, оставшиеся в больном организме, уничтожить облучением, исправленные клетки получат возможность размножаться и производить здоровые клетки крови.
Опасна ли система CRISPR? На нынешнем уровне развития нет. Опасения в большей степени связаны с тем, что редактировать геном человека с целью лечения наследственных заболеваний пока еще рано. Технология пока еще сырая. Так, работы китайских ученых были раскритикованы за большое количество разрывов ДНК, возникших не в том месте. Кроме того, только в нескольких из полусотни эмбрионов была произведена правильная замена участка гена.
Если технология редактирования генома и избавит человечество от наследственных заболеваний, рака, вирусов, то это дело будущего, которое, возможно, гораздо дальше, чем думают оптимисты. Что же касается создания улучшенных людей и связанных с этим этических проблем, то это вообще за пределами того, на что способна система CRISPR.
В начале 2013 года несколько групп ученых показали, что системы CRISPR/Cas могут работать не только в клетках бактерий, но и в клетках высших организмов, а значит, CRISPR/Cas-системы дают возможность исправлять неправильные последовательности генов и таким образом лечить наследственные заболевания человека.
Никто не мог предположить, что практическая возможность лечить генетические болезни человека появится «благодаря» бактериям. В конце 80-х годов японские ученые частично секвенировали геном кишечной палочки и нашли интересный участок, который ничего не кодировал. Этот участок содержал повторяющиеся последовательности ДНК, разделенные вариабельными участками – спейсерами. Наличие протяженного некодирующего участка удивило японцев, так как бактерии экономно относятся к своей ДНК и обычно не несут лишних последовательностей. Позже подобные «кассеты» повторов и спейсеров найдут у большого количества бактерий и архей и назовут CRISPR.
Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой – опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах. Это свойство, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компанияDanisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.
В начале 2000-х годов несколько ученых независимо друг от друга сравнили последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК, депонированными в публичные базы данных. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были похожи на последовательности вирусов. Это позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. Результаты были опубликованы в журналах, находящихся в нижней части научной «табели о рангах», и в общем мало кого заинтересовали. Тогда же были обнаружены Cas-гены, часто расположенные рядом с CRISPR-кассетами. Группа биоинформатика Евгения Кунина предложила довольно детальную гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
При промышленном производстве кисломолочных продуктов вирусы-бактериофаги, случайно попадающие в ферментеры (огромные чаны с молоком и внесенными туда молочнокислыми бактериями), нарушают ферментацию, что приводит к огромным убыткам. Для того чтобы этого избежать, нужно использовать устойчивые к вирусам бактерии. Вывести такие бактерии просто: достаточно в лабораторных условиях отобрать клоны бактерий, способные к росту в присутствии вируса. Эту процедуру и провели в компании Danisco, но при выборке заметили одну важную особенность. Оказалось, что в CRISPR-кассетах клонов, ставших устойчивыми к вирусу, появлялись новые спейсеры, соответствовавшие участкам вирусного генома. Тогда ученые провели прямой эксперимент и методами молекулярной генетики вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в CRISPR-кассету бактерии. И такая генно-модифицированная бактерия действительно оказалась устойчивой к вирусу. Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров. Немногим позже в Science была опубликована статья группой Джона ван дер Ооста (prof. dr. John van der Oost) «CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea», в которой показывалось, что система действительно работает через малые CRISPR РНК. Статья была выпущена в соавторстве с группой Кунина.
Исходные системы, предсказанные в группе Кунина и другими учеными, кодировали большое количество Cas-белков, необходимых для бактериальной защиты. Но также был обнаружен класс систем, которые кодировали только один Cas-белок, правда очень большой. Защитное действие таких систем было продемонстрировано французской исследовательницей Эммануэль Шарпентье. Если в стандартных системах несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем этот комплекс узнает вирусную ДНК-мишень и привлекает еще один белок, «кусающий» вирусную ДНК, то в системе, которую повезло изучать Шарпентье, один белок, получивший название Cas9, выполняет все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и «раскусывает» ее.
В 2012 году группы Шарпентье и Дженнифер Дудны из Университета Беркли опубликовали совместную статью в Science, где предложили способ перепрограммирования системы CRISPR/Cas таким образом, чтобы она стала направленно разрезать ДНК в участках, целенаправленно выбранных исследователем. В природе CRISPR РНК кодируется в CRISPR-кассете, связывается белками и потом узнает мишень. Оказалось, что можно получать неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 способен «узнать» и связаться с такой синтетической СRISPR РНК (ее называют «гид») и становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в ДНК. Группы Шарпентье и Дудны продемонстрировали возможность такого подхода in vitro, то есть в пробирке.
Практически в это же время группы Джорджа Черча и его бывшего аспиранта Фенга Жанга (Feng Zhang) из Института Броуда в MIT показали, что бактериальный белок Cas9 и гид РНК способны «работать», узнавать и направленно разрезать ДНК в клетках высших организмов, в частности человека. MIT успел подать заявку на патент на день раньше, чем Беркли. С тех пор между двумя университетами начались патентные войны, которые продолжаются до сих пор.
Мы диплоиды. Это значит, что у нас двойной набор хромосом – по одному от папы и мамы. Если одна из родительских хромосом «неправильная», то есть в ней изменена последовательность ДНК в каком-то важном гене, может возникнуть состояние носительства генетической болезни, а если обе копии неправильные – возникнет генетическая болезнь. Классический пример – гемофилия у царевича Алексея Романова. Его бабка Виктория передала ему неправильную копию гена на X-хромосоме, хотя сама от гемофилии не страдала, потому что у нее две X-хромосомы и вместо дефектной работала здоровая хромосома. А Алексею не повезло, ведь у него только одна Х-хромосома.
Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, затронутую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме 6 миллиардов букв. Это тысячи книг размером с «Войну и мир». Мы должны найти только одну «опечатку» и исправить ее в заданном месте, не изменив ничего больше. Это и есть задача геномной медицины.
Чтобы исправить «неправильный» ген, нам нужен очень точный молекулярный «скальпель», который найдет мутантную последовательность нуклеотидов и сможет «вырезать» ее из ДНК. Таким «скальпелем» и является Cas9. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. Узнавание мишени происходит на участке длиной в 20–30 нуклеотидов. В среднем последовательности такой длины встречаются в геноме человека единожды, что позволяет обеспечить точность. Клетка не умрет от внесения разрыва в ДНК, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации ДНК. Если парной хромосомы нет, как в случае гемофилии, можно внести в клетку участок «правильного» гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и использовать его как матрицу для залечивания внесенного разрыва.
С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.
В целом описанный механизм функционирует за счет принципа комплементарности, который впервые был предложен Джимом Уотсоном и Френсисом Криком в их знаменитой модели двуцепочечной ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК «узнают» друг друга по правилам комплементарности. CRISPR РНК узнает свои мишени в двуцепочечной ДНК таким же образом, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».
Параллельно с системой CRISPR/Cas9 развивались и другие подходы к редактированию генома, а именно с помощью TALEN-белков и белков с так называемыми цинковыми пальцами. Это генно-инженерные белки, которые могут «кусать» ДНК. Ученые пытались научить их узнавать специфическую, в идеале – любую заданную последовательность ДНК. Иногда это работало, но для каждой последовательности приходилось создавать свой отдельный белок, а это кропотливая и долгая работа. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок, а РНК-гид можно создать за короткое время в любой приличной лаборатории или просто купить. Это совершенно новый уровень редактирования, дешевый и точный. Его основное преимущество в том, что он основан на простом принципе комплементарного узнавания, который используется для узнавания последовательности одних нуклеиновых кислот с помощью других, комплементарных нуклеиновых кислот.
В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, что именно нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие болезни – сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов. Например, многие ученые ищут гены шизофрении и алкоголизма, каждый год находят новые, каждый год часть ранее отрытых генов оказывается ни при чем. Как лечить такие сложные болезни с помощью CRISPR/Cas9 – непонятно, и, очевидно, потребуются мультиплексные подходы.
Надо понимать, что практическое применение CRISPR/Cas9 в медицине – это скорее отдаленное будущее, потребуется еще масса работы, улучшения технологии, ее надежности и безопасности. В целом ситуация с болезнями крови лучше, так как испорченный ген нужен только для кроветворения, а технологии клеточной терапии для таких болезней хорошо отработаны. Предположим, человек болеет лейкемией. Сейчас, для того чтобы устранить болезнь, его облучат, найдут подходящего донора и пересадят костный мозг. Донора искать долго, а полного иммунологического соответствия никогда не бывает.
Используя систему CRISPR/Cas9, мы могли бы получить образец костного мозга пациента и вылечить его собственные кроветворные стволовые клетки, изменив неправильную букву. Затем пациента придется облучить, чтобы убить пораженные кроветворные клетки, и ввести его же собственные отредактированные клетки обратно – не клетки ближайшего родственника или вообще незнакомого человека, а именно его, полностью совместимые. Они начнут делиться и производить здоровые кровяные клетки. Если же речь идет о редактировании, например, опухоли печени, все гораздо сложнее. Нужно будет решить главную медицинскую проблему – проблему доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы именно к пораженным клеткам.
В 2015 году китайские ученые предприняли попытку исправить геном человеческого эмбриона. Они взяли оплодотворенную человеческую яйцеклетку с испорченным геном, приводящим к болезни крови бета-талассемии. В клетку были введены белок Cas9 и РНК-гид, которые должны были найти и «раскусить» неправильную копию гена с последующей репарацией по здоровой матрице. В результате эксперимента в 5-10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение болезни у взрослых людей, действительно была исправлена. Это хорошая новость.
Плохая новость заключалась в том, что во всех клетках пролеченных эмбрионов присутствовало большое количество мутаций, которые появились вовсе не там, где предполагалось. Таким образом, технология нуждается в совершенствовании, она недостаточно точная. Точное редактирование получается, когда участок ДНК-мишени длиной чуть больше 20 нуклеотидов комплементарно взаимодействует с полностью соответствующим ему РНК-гидом. Но ведь в геноме может существовать большое количество вариантов последовательности-мишени, отличающихся от нее лишь на одну букву, еще больше вариантов, отличающихся на две, и так далее. Каждая из таких вариантных мишеней взаимодействует хуже, чем идеально подходящая мишень, допустим в 10 раз хуже. Но так как таких последовательностей много, неправильного узнавания (а следовательно, разрезания и редактирования) избежать очень трудно. Как с этим быть, пока неясно. Очевидно, нужно улучшать специфичность белка Cas9 и очень тщательно выбирать гиды.
Сегодня CRISPR – одна из самых востребованных технологий. Многие молодые люди, студенты, грезят о работе с CRISPRами. Но сейчас эти исследования становятся в общем технологическими. Фундаментальных вопросов осталось немного. В мире есть несколько устоявшихся сильных групп, конкуренция очень сильна. Перспективнее заняться тем, что через 5-10 лет могло бы выстрелить, повторить успех CRISPR/Cas. Но где будет следующий прорыв, предсказать нельзя, в этом и состоит прелесть науки, и это то, что делает бессмысленным всяческие форсайты и приводит в неистовство различных научных предсказателей-«экспертов». Интересно, что эта пока еще неизвестная область будущего прорыва вовсе не должна быть сейчас в мейнстриме, быть «важной». Ведь еще 10 лет назад никто из «серьезных» ученых CRISPRами не занимался. Кстати, CRISPR/Cas – это уже второй случай того, как работы по изучению взаимодействия бактерий и их вирусов приводят к революции в биомедицине. Первая революция произошла в 1970-х годах, когда были открыты ферменты рестрикции, без которых невозможно молекулярное клонирование и генная инженерия.
Среди имеющихся нерешенных проблем по биологии CRISPR/Cas-систем можно выделить следующие. Мы не знаем, откуда берется большинство спейсеров. Ведь только несколько процентов спейсеров имеют вирусное происхождение, похожи на участки ДНК известных вирусов, все остальные, подавляющее большинство, не похожи ни на что. Интересен вопрос эволюционного происхождения СRISPR/Cas-систем. Кунин предложил гипотезу, что они родственны транспозонам – участкам ДНК, которые кодируют специальные белки, занятые перестановкой тех самых участков ДНК, которые их кодируют. Такие необычные прыгающие гены. Сейчас эту гипотезу стараются подтвердить экспериментально. Кроме того, вполне актуален поиск новых, еще неизвестных CRISPR/Cas-систем. До недавнего времени было известно три разных типа, один из которых, тип II, оказался пригодным для редактирования. Недавно наша лаборатория в Сколтехе и Ратгерсе в сотрудничестве с группами Кунина и Жанга предсказала и экспериментально подтвердила наличие трех дополнительных типов этих систем, то есть мы не знаем всего их разнообразия. А среди неизвестных систем могут быть и такие, которые перспективны с практической точки зрения и свободны от недостатков систем на основе Cas9.
Другая интересная цель исследований, имеющая и очевидный практический интерес, – понять молекулярный механизм узнавания мишени и научиться контролировать этот процесс. Это частный случай общей проблемы специфического взаимодействия макромолекул. Ученые не очень хорошо понимают, как в клетке молекулы белков, нуклеиновых кислот находят своих «правильных» партнеров и избегают «неправильных» взаимодействий.
CRISPR уже продемонстрировал отличные результаты в первых клинических испытаниях на людях, которые были проведены в Китае. Китайские специалисты отключили ген PD-1 в иммунных клетках, изъятых из организма пациентов с агрессивной формой рака. Отредактированные клетки были введены обратно в тела людей. Ген PD-1 является своего рода выключателем иммунитета, которым словно лазейкой пользуются раковые клетки. А раз у иммунитета больше нет этого выключателя, то и обойти защиту организма рак больше не способен.
Клинические испытания генного редактирования в США начнутся уже очень скоро. Американцы планируют зайти в экспериментах ещё дальше. Они отключат в иммунных клетках ген PD-1 и ещё два дополнительных гена, благодаря чему иммунитет сможет успешно бороться с самыми разными раковыми опухолями ещё более эффективно. Если эти испытания пройдут успешно, человечество впервые за долгое время сможет вздохнуть спокойно, ведь получится, что мы, наконец, одержали победу над ещё одним смертельным заболеванием.
Метод редактирования ДНК CRISPR/Cas9 рассматривается одним из важнейших научных открытий в современной генетике. Однако за большим потенциалом технологии скрываются чудовищные побочные эффекты. Выяснить это ученым позволил обширный анализ результатов редактирования клеточного генома мышей, а также людей. О выводах исследования ученые поделились в журнале Nature Biotechnology.
Ученые из Института Сенгера (Великобритания) выяснили, что использование системы CRISPR/Cas9 для редактирования клеток человека и животных часто приводит к появлению обширных нежелательных мутаций. «Эта первая систематическая оценка неожиданных последствий использования метода редактирования ДНК CRISPR/Cas9 в терапевтически значимых клетках», – комментирует результаты исследования британский генетик Алан Брэдли. «Мы выяснили, что изменения в ДНК при использовании этого метода были серьезно недооценены в результате прошлых исследований».
Тем не менее это не первый случай, когда ученые бьют тревогу по поводу потенциальной опасности использования технологии CRISPR. Недавно команда ученых из Колумбийского университета заявила о том, что CRISPR/Cas9 вносит множество изменений в ДНК за пределами нужного участка. Хотя подтвердить результаты этого исследования на тот момент не удалось, другие ученые также получили свидетельства того, что система CRISPR вызывает больше побочных эффектов, чем считалось ранее.
Для оценки последствий использования технологии CRISPR в новом исследовании Брэдли и его команда применили ее на стволовые клетки мышей и эпителиальные клетки сетчатки человека. Оказалось, что система вызывает масштабные генетические перестройки, в том числе делеции (потерю участков хромосомы), затрагивающие несколько тысяч пар оснований, расположенных в вдали от того участка, который непосредственно редактировался с помощью CRISPR. Такие мутации способны необратимо повредить важные гены, что станет смертельно опасным для пациентов, которым может проводиться такая генная терапия. «Осознав масштабы генетических перестановок, мы начали проводить их систематически изучение, рассматривая разные гены и разные терапевтически значимые линии. Мы выяснили, что во всех них эффект сохраняется», – рассказывает аспирант Майкл Косицки.
При этом ученые отмечают, что опасность состоит не только в том, что эти мутации могут быть опасными, но еще и в том, что повреждения в геноме не обнаруживаются стандартными методами ДНК-генотипирования. В худшем случае при лечении человека с помощью метода редактирования генома CRISPR/Cas9 можно повредить важные гены, нанеся здоровью катастрофический вред. «В клинической практике проводится редактирование миллиардов клеток. Многие мутации создают вероятность того, что одна или несколько отредактированных клеток окажутся поражены. Такие поражения могут привести к запуску процесса развития рака», – сообщают авторы работы. «Очень важно, чтобы к использованию данной технологии генной терапии подходили с осторожностью. А также внимательно изучали возможные негативные эффекты», – подытожил Брэдли.
Знаменитая технология CRISPR/Cas9, которая позволяет вносить изменения в геном высших организмов, включая человека, стала настоящим прорывом в генетике и открыла перед учёными практически бесконечные возможности для экспериментов. Именно на неё делают ставку в надежде однажды победить такие заболевания, как рак, ВИЧ, наследственные генетические болезни и многие другие. Однако CRISPR/Cas9 далеко не идеальный инструмент, поэтому учёные постоянно пытаются найти ему достойную альтернативу. Похоже, что учёным из кембриджского Института Броуда, наконец, это удалось.
Первые эксперименты по редактированию генов в геномах живых существ датируются началом XX века, начиная с момента открытия механизма индуцированного мутагенеза. К середине XX века учёным удалось достаточно точно модифицировать гены бактерий, но для того, чтобы вносить такие изменения в гены человека, понадобилось ещё несколько десятилетий. Система CRISPR/Cas9, изначально открытая в конце 80-х как защитный механизм бактерий от вирусов, действительно стала своего рода революцией в науке. В её основе лежит белок CAS, разрезающий генетические последовательности. В данный момент эта технология активно используется в многочисленных опытах с редактированием генома самых разных организмов, в том числе и человеческих.
Новый инструмент редактирования генома, созданный в Кембридже, в отличие от CRISPR/Cas9, не разрезает цепочку нуклеотидов, а точечно заменяет в ней исключительно всё самое необходимое, не разрушая при этом общую структуру. Делается это при помощи особого фермента, позволяющего менять в ДНК отдельные пары азотистых оснований. Подобная точность в редактировании генов в обозримом будущем позволит учёным одержать победу над множеством наследственных заболеваний, например, над серповидноклеточной анемией и муковисцидозом.
Революционную методику учёные уже успели опробовать на ряде бактерий. В их ДНК точечно модифицировали ген, отвечающий за устойчивость к определённому антибиотику. После чего бактерии лишились всяческой защиты от этого препарата и начали погибать. Но на этом учёные решили не останавливаться и провели обратный эксперимент, вернув бактериям прежнюю защиту. Эксперимент также завершился удачей. Команда исследователей считают, что их инструмент редактирования гораздо более гибкий и эффективный, нежели CRISPR/Cas9, поэтому со временем он оттеснит устаревшую систему на второй план. Результаты исследований были опубликованы в журнале Nature.
Если бы у вас была возможность изменить генетику своего ребенка, вы бы пошли на это? Вы пошли бы на то, чтобы предотвратить врожденный порок? Разве это не было бы преступлением: не исправить то, что можно было исправить?
Раз уж мы создали CRISPR/Cas9, инструмент, позволяющий «редактировать» человеческий геном с невероятной точностью, эти вопросы уже перестали быть теоретическими и философскими – и стали очень, очень реальными. Всего несколько лет спустя после первоначальной разработки, технология CRISPR уже широко используется биологами в качестве инструмента поиска и изменения ДНК, вплоть до одной буквы. Но редактирование ДНК этих клеток или самого эмбриона (зародышевая инженерия) позволяет исправить больные гены и передать эти генетические исправления грядущим поколениям. Например, можно было бы избавить семьи от кистозного фиброза и мышечной дистрофии. Такой подход может быть столь же важным, что и создание вакцины от одной из «вечных» болезней.
Что самое любопытное, общественное мнение не то чтобы сильно негативно относилось к идее модификации младенцев. Исследование Pew Research, проведенное в августе, показало, что 46% взрослых американцев поощряют использование генетических улучшений ребенка, чтобы снизить риск получения серьезных заболеваний. При том что те же 83% считают генетическую модификацию, которая сделает ребенка умнее, «чрезмерной медициной».
В США над зародышевой инженерией активно работает еще три центра. Особое рвение в этой сфере проявляет Китай, а также Великобритания. Цель всех групп – продемонстрировать, что можно родить ребенка, у которого не будет особых генов, отвечающих за наследственные заболевания. Если можно скорректировать ДНК в яйцеклетке женщины или в сперме мужчины, эти клетки можно было бы использовать в клинике экстракорпорального оплодотворения для производства эмбриона, а затем и ребенка. Можно было бы также напрямую редактировать ДНК в эмбрионе на ранних стадиях ЭКО, используя CRISPR.
Жизнь становится программируемой. Эти изменения ждут нас уже в ближайшие десять лет. Но будущее будет еще более захватывающим. Метод редактирования генов CRISPR оказался в центре внимания после того, как ученые сообщили, что использовали его для безопасного удаления болезни из человеческих эмбрионов, впервые. За этим последовала «лихорадка CRISPR», которая продолжается вот уже несколько лет, и число научных публикаций по этой теме неуклонно растет.
Есть веские причины повышенного внимания к CRISPR.Этот метод позволяет ученым «вырезать и вставлять» ДНК еще проще, чем когда-либо. Он применяется в самых разных сферах, начиная от лечения рака и заканчивая контролем заболеваний, переносимых насекомыми. Некоторые из этих применений, такие как создание москитов, способных противостоять паразиту, вызывающему малярию, неизбежно приводят к перенастройке экосистемы. Поэтому CRISPR вызывает множество опасений этики и безопасности. Некоторые также обеспокоены тем, что применения, изучаемые оборонными организациями, интересующимися «инновационными применениями», должны послужить тревожным звоночком для других государств.
Существуют также опасения, что редактирование генов смогут использовать при разработке биологического оружия. В 2016 году Билл Гейтс заметил, что «следующая эпидемия может возникнуть на экране компьютера с намерением террористов использовать генетическую инженерию для создания синтетической версии вируса оспы». Совсем недавно, в июле 2017 года, Джон Сотос из Intel Health & Life Sciences, заявил, что исследования по редактированию генов могут «открыть потенциал для биооружия невообразимого разрушительного потенциала».
В феврале 2016 года стало очевидно, что широкая доступность и низкая стоимость основных ингредиентов технологий вроде CRISPR, делает это особенно актуальным. Тем не менее, нужно быть осторожными с шумихой вокруг новых технологий и, в настоящее время, возможности CRISPR скорее скромны и преувеличены. Существуют методы террора и проще, и грубее. Пока что CRISPR мог привлечь только биологических террористов. Но необходимы и другие шаги, такие как распространение и выращивание агентов биологического оружия, чтобы оно было эффективным. Для этого нужны дополнительные навыки, и создание биологического оружия на основе CRISPR будет оставаться недоступным для большинства террористических группировок. По крайней мере, пока. Но это не значит, что злонамеренно использовать CRISPR невозможно. Как и невозможно игнорировать важную роль CRISPR в любой биологической программе будущего.
Стоит отметить, что большинство государств по всему миру питают отвращение к биологической войне. Активно внедряются методы, препятствующие разработке биологического оружия. На международной уровне действует Конвенция о биологическом и токсинном оружии. Согласно этой конвенции, «страны договорились никогда и ни при каких обстоятельствах не приобретать и не хранить биологическое оружие».
Это соглашение не идеально и обеспечить его соблюдение довольно трудно. Более того, в последнее время страны-участники соглашения не особо бдительно следят за его исполнением, а на последней встрече и вовсе не смогли договориться о дальнейшей работе. Пока это наш краеугольный камень борьбы с биологическим оружием. Все 178 государств, подписавших соглашение, в декабре 2016 года заявили о своей «железной решительности полностью исключить возможность использования биологического оружия и убежденности в том, что такое использование будет отвратительным для совести человечества».
Следовательно, этим государствам придется рассмотреть враждебный потенциал CRISPR. Более того, они должны сделать это коллективно. Важны односторонние национальные меры, проведения процедур обеспечения биологической безопасности. Однако добиться запрета на враждебное использование CRISPR отдельно взятому государству вряд ли удастся.
Таким образом, государствам-участникам конвенции важно договориться на более систематический и регулярный обзор науки и техники. Такие обзоры могут помочь в выявлении и определении степени опасности таких технологий, как CRISPR, а также в предоставлении международного обмена информации о некоторых потенциальных преимуществах таких технологий.
Большинство государств поддержали принцип расширенных обзоров науки и техники в рамках конвенции на последнем крупном совещании. Но теперь им необходимо воспользоваться этой возможностью и договориться о практическом внедрении таковых обзоров, чтобы не допустить, что конвенция останется за рамками развития науки и технологий.
Биологическая война не является неизбежным следствием достижений в области наук о жизни. Для разработки и использования биологического оружия необходимо соответствующее агентство. Несовершенная конвенция не сможет гарантировать, что государства-участники всегда смогут выступить против вредоносного применения достижений биологии. Но они могут повлиять на эти решения и сформировать среду, в которой недостатки поиска такого оружия перевешивают преимущества.
|
